本发明涉及聚乙二醇生物降解技术领域，具体地说是一种聚乙二醇水解菌株及水解能力的验证方法。聚乙二醇水解菌为革兰氏染色反应阴性菌PEGHB-04，经鉴定为无色杆菌属（Achromobactersp.）。主要生物学特性为G
1.一株聚乙二醇水解无色杆菌（Achromobacterxa0sp.）菌株PEGHB-04，其保藏编号为CGMCCxa0NO.7142。
2.权利要求1所述的无色杆菌菌株PEGHB-04在聚乙二醇水解中的应用。
3.权利要求1所述的无色杆菌菌株PEGHB-04水解聚乙二醇的方法，包括如下步骤：1）将纯化得到的菌株挑至诱导培养基中，于30℃、160r/min振荡培养至菌体生长对数后期，即OD600≈2.5；2）将步骤1）得到的培养液在离心力6000g下离心3min，弃上清液，加入等体积的100mmol/L，pH7.0的磷酸缓冲液PBS摇匀后，在离心力6xa0000g下离心3min，以此方法冲洗2次，然后用100ml无机盐液体培养基重悬；3）在步骤2）的100ml重悬液中加入0.5gxa0PEG1000，即聚乙二醇1000，并于30℃、160r/min下振荡18xa0h；所述的诱导培养基的组成为：PEG1000xa05.0g，蛋白胨xa010.0g，NaClxa05.0g，酵母膏xa04.0g，去离子水xa01000ml，pHxa07.0。
4.根据权利要求3所述的水解聚乙二醇的方法，其特征在于：所述步骤2）中的无机盐液体培养基为：每升去离子水中含1.50xa0gxa0K₂HPO₄、0.50xa0gxa0KH₂PO₄、0.20xa0gxa0MgSO₄×7H₂O、1.00xa0gxa0NaCl、1.00xa0gxa0(NH₄)₂SO₄，pHxa07.0。技术领域
本发明涉及环境微生物技术领域，具体地说是一种聚乙二醇水解无色杆菌PEGHB-04及其应用。
背景技术
聚乙二醇(PEG)又称聚乙二醇醚，化学结构式为H(CH₂CH₂OCH₂CH₂)_nOH，它包括一系列由低到中等分子量的产品，其相对分子质量范围从200到20000。通常工业生产中是以环氧已烷与乙二醇或者水慢慢加成而获得，因为蒸汽压大小的原因，我们通常得到的聚乙二醇产品均为不同聚合度的聚乙二醇的混合物。聚乙二醇具备润滑、水溶、稳定、低毒、难挥发、易互溶等优越的性能，而且该聚合物的分子量有可变性，从而它被广泛应用于医药品、化妆品、润滑剂、防冻剂的生产，并大量用作非离子型表面活性剂和多晶硅切割液。全球范围内每年生产数百万吨的聚乙二醇，并且绝大部分最终进入水体环境中，造成严重的环境污染。一般来说，聚乙二醇相对分子量越大，生物降解越难，分子量越小，则较容易进行生物降解。目前，国内外研究报道主要为单株或者多株菌株协同降解聚乙二醇，但这些报道的菌株对大分子量聚乙二醇降解速率较慢。因此，聚乙二醇水解菌对提高聚乙二醇生化降解速率具有十分重要的意义，但目前仍未见聚乙二醇水解菌株及水解能力验证方法的报道。
发明内容
本发明的目的在于针对大分子量聚乙二醇降解速率较慢，提供了一种聚乙二醇水解无色杆菌PEGHB-04及其应用。本发明提供了一种聚乙二醇水解菌株，其菌株PEGHB-04是一株革兰氏阴性菌，于2013年1月15日保藏于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏编号xa0xa0CGMCCxa0NO.7142，经鉴定为无色杆菌属（Achromobacterxa0sp.）。主要生物学特性为G^-，在LB固体培养基上，培养基配方为：酵母膏5.00，蛋白胨10.00，NaClxa010.00，琼脂20.00g，去离子水1000ml，pHxa07.0，30℃恒温培养3天后，其菌落为圆形，边缘光滑；经结晶紫染色后，在显微镜下观察菌为杆状，无芽孢，大小0.8~1.3×0.5~0.6μm；对明胶水解、淀粉水解、接触酶呈阳性；对硝酸盐还原、M.R试验、V.P试验、吲哚试验呈阴性。本发明提供了聚乙二醇水解菌株PEGHB-04在聚乙二醇水解中的应用。本发明还提供了一种菌株PEGHB-04水解聚乙二醇的方法，包括如下步骤：1）将纯化得到的菌株挑至诱导培养基中，于30℃、160r/min振荡培养至菌体生长对数后期，即OD600≈2.5；2）将步骤1）得到的培养液在离心力6000g下离心3min，弃上清液，加入等体积的100mmol/L，pH7.0的磷酸缓冲液PBS摇匀后，在离心力6xa0000g下离心3min，以此方法冲洗2次，然后用100ml无机盐液体培养基重悬；3）在步骤2）的100ml重悬液中加入0.5gxa0PEG1000，即聚乙二醇1000，并于30℃、160r/min下振荡18xa0h。所述步骤1）中的诱导培养基的组成为：PEG1000xa05.0g，蛋白胨xa010.0g，NaClxa05.0g，酵母膏xa04.0g，去离子水xa01000ml，pHxa07.0。所述步骤2）中的无机盐液体培养基为：每升去离子水中含1.50xa0gxa0K₂HPO₄、0.50xa0gxa0KH₂PO₄、0.20xa0gxa0MgSO₄×7H₂O、1.00xa0gxa0NaCl、1.00xa0gxa0(NH₄)₂SO₄，xa0pHxa07.0。本发明所有具有的优点：1）本发明提供的一种聚乙二醇水解菌，大大提高聚乙二醇生物降解效率，在实践中具有很好的应用前景；2）本发明采用的LC-MS验证聚乙二醇水解能力，技术先进，高效精准，稳定可靠，具有很好可行性和推广性；3）本发明确定了聚乙二醇LC-MS分析的基本条件，为其他聚合物的相关分析提供了一定的理论指导。
附图说明
图1聚乙二醇水解菌PEGHB-04菌落照片。图2聚乙二醇水解菌PEGHB-04菌体结晶紫染色照片（1000X）。图3xa0PEG1000水解前后的LC-MS图谱；其中：A.xa0PEG1000水解前;xa0B.xa0PEG1000被菌株水解后。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1聚乙二醇水解菌PEGHB-04的筛选与分离取被聚乙二醇长期污染的土壤5.0g,加入至含PEG1000浓度为1000mg/L的100ml无机盐培养基中，无机盐培养基配方为：每升去离子水中含1.50xa0gxa0K₂HPO₄、0.50xa0gxa0KH₂PO₄、0.20xa0gxa0MgSO₄×7H₂O、1.00xa0gxa0NaCl、1.00xa0gxa0(NH₄)₂SO₄，xa0pHxa07.0，于160r/min，30℃条件下振荡培养，每隔3天按5%的接种量转接到新鲜的无机盐培养基中，连续转接4次。取上面得到的富集菌液1.0ml，加入9.0ml无菌水中，配成10^-1的富集液，再吸取1.0ml配好的10^-1的富集液加入9.0ml无菌水中，充分混匀配成10^-2的富集液，以此类推，对富集液进行梯度稀释。以此类推，对富集液进行梯度稀释。吸取各梯度的稀释液0.1ml涂布于PEG1000的浓度为1000mg/L无机盐固体培养基上，固体培养基配方为：每升去离子水中含1.50xa0gxa0K₂HPO₄、0.50xa0gxa0KH₂PO₄、0.20xa0gxa0MgSO₄×7H₂O、1.00xa0gxa0NaCl、1.00xa0gxa0(NH₄)₂SO₄，20.00gxa0琼脂，xa0pHxa07.0，30℃恒温培养3天。3天后从以上的无机盐固体培养基上挑取单菌落，于LB固体培养基中划线分离纯化，LB固体培养基配方：酵母膏5.00，蛋白胨10.00，NaClxa010.00，琼脂20.00,去离子水1000ml，pHxa07.0。将纯化后的单菌分别接种至含PEG1000浓度为5000mg/L的LB液体培养基中，LB培养基配方为：酵母膏5.00，蛋白胨10.00，NaClxa010.00，去离子水1000ml，pHxa07.0，于30℃、160/min振荡培养至菌体生长对数后期，即OD600≈2.5。将得到的培养液在离心力6000g下离心3min，弃上清液，用pH7.0的100mmol/L磷酸缓冲液PBS冲洗2次，再用100mlxa0无机盐液体培养基重悬，再往该重悬液中加入0.50gxa0PEG1000，于30℃、160r/min下振荡18xa0h，离心去除菌体，用LC-MS分析验证菌株对PEG1000是否有水解能力。选取水解能力较高的菌株进行后续试验。将降解菌株接种于LB固体培养基上,xa030℃恒温培养30h后观察菌落形态，用光学显微镜观察菌体形态（1000X）。菌株的生理生化鉴定按照《常见细菌系统鉴定手册》进行。其菌落图片见图1，特征为圆形，边缘光滑，鉴定为无色杆菌属（Achromobacterxa0sp.），命名为PEGHB-04，主要生物学特性为格兰氏阴性，结晶紫染色照片如图2所示，杆状，无芽孢，大小0.8~1.3×0.5~0.6μm；对明胶水解、淀粉水解、接触酶呈阳性；对硝酸盐还原、M.R试验、V.P试验、吲哚试验呈阴性。实施例2xa0菌株PEGHB-04水解聚乙二醇的方法将菌株PEGHB-04接入诱导培养基中，所述诱导培养基配方为：PEG1000xa05.0g，蛋白胨xa010.00g，NaClxa05.00g，酵母膏xa04.00g，去离子水xa01000ml，pHxa07.0，于30℃、160r/min振荡培养至菌体生长对数后期，即OD600≈2.5。将得到的培养液在离心力6000g下离心3min，弃上清液，用pH7.0的100mmol/L磷酸缓冲液PBS冲洗2次，再用100ml无机盐液体培养基重悬，无机盐液体培养基配方为：每升去离子水中含1.50xa0gxa0K₂HPO₄、0.50xa0gxa0KH₂PO₄、0.20xa0gxa0MgSO₄×7H₂O、1.00xa0gxa0NaCl、1.00xa0gxa0(NH₄)₂SO₄，xa0pHxa07.0。在重悬液中加0.5gxa0PEG1000，并于30℃、160r/min下振荡18xa0h。实施例3xa0液相质谱联用检测实验实施例2所得的培养液离心去除菌体，得到的样品进行LC-MS分析，样品先过0.22μm滤膜，以不加菌液的1000mg/Lxa0PEG1000为空白对照。图3-A为PEGxa01000空白样品的总离子流，2个主要离子化峰之间相差相对分子值量为22，即C₂H₄O/2，每个聚合物带2个正电荷。以m/z=539[M/2+Na+Na]²⁺、对应的分子量m=986(n=22)为例，类推的得到PEG1000空白组中含有n=14～29聚合度的聚乙二醇。图3-B为经过菌株PEGHB-04水解后PEG1000的质谱图，当加入菌液的LC-MS图谱中出现大量的低分子量，即聚合度n<14的聚乙二醇，或者聚合度n较大的相对含量下降，除聚合度n=14～29离子化的PEG之外，其他2个主要离子化峰之间相差分子量为44，即C₂H₄O，每个聚合物带1个正电荷，以m/z=437[M+xa0Na]^xa0+、对应的分子量m=414(n=9)为例，类推正好符合n=5～13聚合度PEG的分子量。由此可见，PEG1000经过菌株PEGHB-04处理后，PEG1000由原来的聚合度n=14～29变为n=5～29，表明PEGHB-04能直接水解断裂聚乙二醇中的醚键。即表明菌液对聚乙二醇具有水解效果。LC-MS分析的条件为：液相条件：流动相为纯甲醇；流速为0.25mL/min；质谱条件：离子源为电喷雾离子化源；检测方式为正离子；离子源喷射电压为4.0kv；毛细管电流为30nA；载气温度为350℃；载气流速为8.0~10.0L/min；进样量为15~20μl；扫描方式为全扫描（50～2000m/z）。